Variant Calling and Microarray Expression Analysis in Pancreatic Islet Samples

Abstract This article describes the creation of a pipeline for variant calling from high-throughput next-generation exome and RNA sequencing data using commonly used bioinformatics tools. High-throughput sequencing data from six pancreatic islet cell samples were analyzed using the pipeline, and the resulting variant calls were validated against chip genotyping data from the same individuals. The results indicate that variant calling can be applied to RNA-seq and exome sequencing data to identify genetic variants in exons and coding regions with high precision, while the recall was relatively low. In other words, identified genotypes seem to have a high probability of being correct, but only part of the present variants are picked up. This is especially true for RNA-seq.Populärvetenskaplig sammanfattning Genetisk variation och genuttryck i Langerhanska öar Projekt 1 - Genetisk variation DNA är den mänskliga cellens informationslagringsenhet och består av långa sekvenser av de fyra nukleotiderna adenin(A), tymin(T), cytosin(C) och guanin(G). Proteiner kan binda till DNA och översätta delar av dessa sekvenser(gener) till RNA, en liknande typ av molekyl. RNA kan sedan användas för att organisera tillverkningen av olika proteiner. Dessutom beskriver DNA-sekvensen när och var olika proteiner tillverkas. Det genetiska materialet är uppdelat på 23 långa sekvenser, så kallade kromosomer. Alla celler i kroppen utom könscellerna har två kopior av varje kromosom. Könscellerna har endast en slumpmässigt valt kopia av varje kromosom, vilket gör att avkomman till två personer ärver en kromosom per kromosompar från varje förälder. Det är viktigt att påpeka att de två kromosomerna i varje kromosompar är funktionellt ekvivalenta, men sekvenserna är oftast inte exakt desamma. Undantaget är XY- kromosomparet, där X och Y-versionen har olika funktioner och bestämmer vilket kön barnet får. På det sättet kan varje position på de 22 så kallade somatiska kromosomerna hos varje individ beskrivas med två olika nukleotider, exempelvis A/A, A/T eller A/G. Denna beskrivning kallas för en genotyp. Den här typen av skillnad mellan individer kallas, ifall den är vanligt förekommande i befolkningen, för single nucleotide polymorphism(SNP). Eftersom sådana skillnader kan påverka hur proteiner i kroppen byggs upp, eller förändra när och var olika proteiner tillverkas, kan de ha starka effekter på hur kroppen fungerar. Därför studeras SNP:ar mycket inom medicinsk forskning. Målet med det här projektet var att ta data från de kodande sekvenserna i DNA och från RNA-sekvenser, respektive, och söka igenom datan efter skillnader i olika SNPar. Vi var intresserade av att veta ifall SNPar kunde identifieras korrekt från RNA, ett användningsområde som är relativt ovanligt. SNParna som hittades från de två datakällorna jämfördes med varandra och med en uppsättning SNPar som var kända från en tillförlitlig datakälla. Resultaten visade att SNPar hittade i RNA och kodande DNA hade likartad tillförlitlighet för en uppsättning av ca 30,000 SNPar som vi studerade. SNPar hittade i RNA-data var lika korrekta som SNPar hittade i data från kodande DNA. Färre SNPar hittades dock i RNA-data än i data från kodande DNA. För både RNA-data och kodande DNA visade det sig att SNPar med olika genotyper var olika korrekta. Heterozygota SNPar, alltså SNPar med två olika nukleotider hos en given individ, var mer korrekta än homozygota SNPar, SNPar med två upplagor av samma nukleotid. Projekt 2 – Genuttryck Människan har omkring 20,000 olika gener som kodar för olika proteiner. När en gen översätts till RNA och används för att bilda proteiner säger man att genen uttrycks. Olika vävnader uttrycker olika uppsättningar av gener. Dessutom förändras styrkan av genuttryck beroende på tid, ämnesomsättning och många andra biologiska faktorer. Att studera cellers genuttryck ger därmed en inblick i hur celler, vävnader och organismer fungerar. Ett verktyg för att analysera genuttryck är den så kallade mikroarrayen. Det är en skiva på vilken ett stort antal korta DNA-sekvenser är fastsatta. En lösning med olika RNA-molekyler översätts till DNA-molekyler, och läggs sedan på plattan där de binder till de fastsatta molekylerna. DNA-strängarna i lösningen är kopplade till molekyler som bildar ljus, vilket gör att mängden av varje molekyl på mikroarrayen kan läsas av som en ljusintensitet på arrayen. En liknande metod kallas för bead-array. I denna metod är DNA-sekvenserna fastsatta på ett stort antal mikrometerstora kulor. Dessa kulor läggs i brunnar på en platta. Till skillnad från mikroarrayer är DNA-sekvenserna slumpmässigt placerade på plattan. I Human Tissue Lab i Uppsala finns det stora arkiv med vävnadsprover som har blivit konserverade genom behandling med formalin. Problemet är att formalinet reagerar med RNAt i provet och gör att genuttryck inte kan analyseras rakt av lika bra. Företaget som tillverkar bead-arrays, Illumina, säljer kemikalieuppsättningar som tillsammans med bead-arrays ska minska detta problem. Målet med det här projektet var att jämföra genuttryck mätt med mikroarrayer och bead-arrayer, för att se ifall data från de olika plattformarna är jämförbara. För det första jämfördes de råa intensiteterna på olika plattformar. För det andra jämfördes skillnader mellan olika patientgrupper på olika plattformar. För det tredje jämfördes upp-och nedreglerade grupper av gener i olika patientgrupper på de olika plattformarna. Resultaten visar att råa intensiteter skiljer sig mycket mellan mikroarrayer och bead-arrayer. Olika mikroarrayer visade likartade nivåer av upp-och nedreglerade gener för olika patientgrupper, men kopplingen var starkast för starkt upp-och nedreglerande gener. För gener med mindre skillnader i genuttryck mellan grupper dök gener upp som visade sig som uppreglerade på en plattform, men nedreglerade på en annan, och vice versa. En del gengrupper bedömda som påverkade i olika patientgrupper var gemensamma mellan de två plattformarna, och en del var unika för varje platform. När dessa resultat jämfördes med en tillförligtlig tredje datakälla, RNA-sekvensiering, visade det sig att båda plattformarna var ungefär lika korrekta, men att varje plattform hittade unika korrekta gengrupper som var upp-eller nedreglerade

Hantering av datamängder, programvaror och rådata vid SLU

En enkät skickades till forskare vid Sveriges lantbruksuniversitet (SLU) med frågor rörande deras hantering av forskningsdata, exempelvis vilka datatyper och mjukvaror de använder och hur stora datavolymer de hanterar, deras kunskaper om juridiska aspekter på datahantering och deras attityder till att göra data öppet tillgängliga. I rapporten diskuteras svaren på enkätfrågorna och deras implikationer för framtida arbete med datakurering vid universitetet

Distribution and characteristics of newly-defined subgroups of type 2 diabetes in randomised clinical trials : Post hoc cluster assignment analysis of over 12,000 study participants

Publisher Copyright: © 2022Aims: Newly-defined subgroups of type 2 diabetes mellitus (T2DM) have been reported from real-world cohorts but not in detail from randomised clinical trials (RCTs). Methods: T2DM participants, uncontrolled on different pre-study therapies (n = 12.738; 82 % Caucasian; 44 % with diabetes duration > 10 years) from 14 RCTs, were assigned to new subgroups according to age at onset of diabetes, HbA1c, BMI, and fasting C-peptide using the nearest centroid approach. Subgroup distribution, characteristics and influencing factors were analysed. Results: In both, pooled and single RCTs, “mild-obesity related diabetes” predominated (45 %) with mean BMI of 35 kg/m2. “Severe insulin-resistant diabetes” was found least often (4.6 %) and prevalence of “mild age-related diabetes” (23.9 %) was mainly influenced by age at onset of diabetes and age cut-offs. Subgroup characteristics were widely comparable to those from real-world cohorts, but all subgroups showed higher frequencies of diabetes-related complications which were associated with longer diabetes duration. A high proportion of “severe insulin-deficient diabetes” (25.4 %) was identified with poor pre-study glycaemic control. Conclusions: Classification of RCT participants into newly-defined diabetes subgroups revealed the existence of a heterogeneous population of T2DM. For future RCTs, subgroup-based randomisation of T2DM will better define the target population and relevance of the outcomes by avoiding clinical heterogeneity.Peer reviewe

Regenerating islet-derived protein 3α : A promising therapy for diabetes. Preliminary data in rodents and in humans

Publisher Copyright: © 2022The aim of our study was to test the hypothesis that administration of Regenerating islet-derived protein 3α (Reg3α), a protein described as having protective effects against oxidative stress and anti-inflammatory activity, could participate in the control of glucose homeostasis and potentially be a new target of interest in the treatment of type 2 diabetes. To that end the recombinant human Reg3α protein was administered for one month in insulin-resistant mice fed high fat diet. We performed glucose and insulin tolerance tests, assayed circulating chemokines in plasma and measured glucose uptake in insulin sensitive tissues. We evidenced an increase in insulin sensitivity during an oral glucose tolerance test in ALF-5755 treated mice vs controls and decreased the pro-inflammatory cytokine C-X-C Motif Chemokine Ligand 5 (CXCL5). We also demonstrated an increase in glucose uptake in skeletal muscle. Finally, correlation studies using human and mouse muscle biopsies showed negative correlation between intramuscular Reg3α mRNA expression (or its murine isoform Reg3γ) and insulin resistance. Thus, we have established the proof of concept that Reg3α could be a novel molecule of interest in the treatment of T2D by increasing insulin sensitivity via a skeletal muscle effect.Peer reviewe

Preserving Insulin Secretion in Diabetes by Inhibiting VDAC1 Overexpression and Surface Translocation in beta Cells

Type 2 diabetes (T2D) develops after years of prediabetes during which high glucose (glucotoxicity) impairs insulin secretion. We report that the ATP-conducting mitochondrial outer membrane voltage-dependent anion channel-1 (VDAC1) is upregulated in islets from T2D and non-diabetic organ donors under glucotoxic conditions. This is caused by a glucotoxicity-induced transcriptional program, triggered during years of prediabetes with suboptimal blood glucose control. Metformin counteracts VDAC1 induction. VDAC1 overexpression causes its mistargeting to the plasma membrane of the insulinsecreting beta cells with loss of the crucial metabolic coupling factor ATP. VDAC1 antibodies and inhibitors prevent ATP loss. Through direct inhibition of VDAC1 conductance, metformin, like specific VDAC1 inhibitors and antibodies, restores the impaired generation of ATP and glucose-stimulated insulin secretion in T2D islets. Treatment of db/db mice with VDAC1 inhibitor prevents hyperglycemia, and maintains normal glucose tolerance and physiological regulation of insulin secretion. Thus, beta cell function is preserved by targeting the novel diabetes executer protein VDAC1.Peer reviewe

Mapping the Cord Blood Transcriptome of Pregnancies Affected by Early Maternal Anemia to Identify Signatures of Fetal Programming

Context Anemia during early pregnancy (EP) is common in developing countries and is associated with adverse health consequences for both mothers and children. Offspring of women with EP anemia often have low birth weight, which increases risk for cardiometabolic diseases, including type 2 diabetes (T2D), later in life. Objective We aimed to elucidate mechanisms underlying developmental programming of adult cardiometabolic disease, including epigenetic and transcriptional alterations potentially detectable in umbilical cord blood (UCB) at time of birth. Methods We leveraged global transcriptome- and accompanying epigenome-wide changes in 48 UCB from newborns of EP anemic Tanzanian mothers and 50 controls to identify differentially expressed genes (DEGs) in UCB exposed to maternal EP anemia. DEGs were assessed for association with neonatal anthropometry and cord insulin levels. These genes were further studied in expression data from human fetal pancreas and adult islets to understand their role in beta-cell development and/or function. Results The expression of 137 genes was altered in UCB of newborns exposed to maternal EP anemia. These putative signatures of fetal programming, which included the birth weight locus LCORL, were potentially mediated by epigenetic changes in 27 genes and associated with neonatal anthropometry. Among the DEGs were P2RX7, PIK3C2B, and NUMBL, which potentially influence beta-cell development. Insulin levels were lower in EP anemia-exposed UCB, supporting the notion of developmental programming of pancreatic beta-cell dysfunction and subsequently increased risk of T2D in offspring of mothers with EP anemia. Conclusions Our data provide proof-of-concept on distinct transcriptional and epigenetic changes detectable in UCB from newborns exposed to maternal EP anemia.Peer reviewe

Islet Gene View-a tool to facilitate islet research

Characterization of gene expression in pancreatic islets and its alteration in type 2 diabetes (T2D) are vital in understanding islet function and T2D pathogenesis. We leveraged RNA sequencing and genome-wide genotyping in islets from 188 donors to create the Islet Gene View (IGW) platform to make this information easily accessible to the scientific community. Expression data were related to islet phenotypes, diabetes status, other islet-expressed genes, islet hormone-encoding genes and for expression in insulin target tissues. The IGW web application produces output graphs for a particular gene of interest. In IGW, 284 differentially expressed genes (DEGs) were identified in T2D donor islets compared with controls. Forty percent of DEGs showed cell-type enrichment and a large proportion significantly co-expressed with islet hormone-encoding genes; glucagon (GCG, 56%), amylin (IAPP, 52%), insulin (INS, 44%), and somatostatin (SST, 24%). Inhibition of two DEGs, UNC5D and SERPINE2, impaired glucose-stimulated insulin secretion and impacted cell survival in a human beta-cell model. The exploratory use of IGW could help designing more comprehensive functional follow-up studies and serve to identify therapeutic targets in T2D.Peer reviewe

Exercise is associated with younger methylome and transcriptome profiles in human skeletal muscle

Exercise training prevents age-related decline in muscle function. Targeting epigenetic aging is a promising actionable mechanism and late-life exercise mitigates epigenetic aging in rodent muscle. Whether exercise training can decelerate, or reverse epigenetic aging in humans is unknown. Here, we performed a powerful meta-analysis of the methylome and transcriptome of an unprecedented number of human skeletal muscle samples (n = 3176). We show that: (1) individuals with higher baseline aerobic fitness have younger epigenetic and transcriptomic profiles, (2) exercise training leads to significant shifts of epigenetic and transcriptomic patterns toward a younger profile, and (3) muscle disuse "ages" the transcriptome. Higher fitness levels were associated with attenuated differential methylation and transcription during aging. Furthermore, both epigenetic and transcriptomic profiles shifted toward a younger state after exercise training interventions, while the transcriptome shifted toward an older state after forced muscle disuse. We demonstrate that exercise training targets many of the age-related transcripts and DNA methylation loci to maintain younger methylome and transcriptome profiles, specifically in genes related to muscle structure, metabolism, and mitochondrial function. Our comprehensive analysis will inform future studies aiming to identify the best combination of therapeutics and exercise regimes to optimize longevity

Life-long impairment of glucose homeostasis upon prenatal exposure to psychostimulants

Maternal drug abuse during pregnancy is a rapidly escalating societal problem. Psychostimulants, including amphetamine, cocaine, and methamphetamine, are amongst the illicit drugs most commonly consumed by pregnant women. Neuropharmacology concepts posit that psychostimulants affect monoamine signaling in the nervous system by their affinities to neurotransmitter reuptake and vesicular transporters to heighten neurotransmitter availability extracellularly. Exacerbated dopamine signaling is particularly considered as a key determinant of psychostimulant action. Much less is known about possible adverse effects of these drugs on peripheral organs, and if in utero exposure induces lifelong pathologies. Here, we addressed this question by combining human RNA-seq data with cellular and mouse models of neuroendocrine development. We show that episodic maternal exposure to psychostimulants during pregnancy coincident with the intrauterine specification of pancreatic beta cells permanently impairs their ability of insulin production, leading to glucose intolerance in adult female but not male offspring. We link psychostimulant action specifically to serotonin signaling and implicate the sex-specific epigenetic reprogramming of serotonin-related gene regulatory networks upstream from the transcription factor Pet1/Fev as determinants of reduced insulin production.Peer reviewe